Šifra predmeta:
434B2		 Naziv predmeta:
Instrumentalne metode u biohemiji

Školska godina:

2023/2024.

Uslovi pohađanja:

302B2 + 401B2 + 221B2

ESPB:

7

Vrsta studija:

osnovne akademske studije

Studijski program:

Biohemija: 4. godina, letnji semestar, izborni (E16B2), stručno-aplikativni predmet

Nastavnik:

dr Tanja D. Ćirković Veličković
redovni profesor, Hemijski fakultet, Studentski trg 12-16, Beograd

Saradnici:

—

Fond časova:

Nedeljno: dva časa predavanja + četiri časa laboratorijskih vežbi (2+0+4)

Ciljevi:

Kurs je namenjen studentima koji žele da steknu znanja i praktičnu obuku za rad na instrumentima koji se koriste u biohemiji za određivanje strukture i modifikacija proteina i ispitivanja interakcija liganda i makromakromolekula (proteina i DNA).

Ishod:

Student je osposobljen da primenjuje moderne instrumentalne metode za određivanje strukture proteina i ispitivanja interakcija liganda i makromolekula.

Oblici nastave:

Predavanja, laboratorijske vežbe, kolokvijumi, seminarski rad.

Vannastavne aktivnosti:

—

Literatura:
  • J. R. Lakowicz: Principles of Fluorescence Spectroscopy, Springer 2006.
  • J. Throck Watson, O. D. Sparkman: Introduction to mass spectrometry, Wiley 2007.
  • G. D. Fasman: Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, Springer, 1996.
  • Nina Berova, Koji Nakanishi, Robert W. Woody: Circular Dichroism: Principles and Applications, Wiley, 2000.
  • J. Lovric: Introducing Proteomics: From concepts to sample separation, mass spectrometry and data analysis, Wiley, 2011.
  • Materijali sa predavanja i vežbi

Dodatni materijal:

—

  Nastavne obaveze i način ocenjivanja

Predavanja:

10 poena (2 časa nedeljno)

Program rada:

  1. Pregled modernih instrumentalnih metoda u bihemiji: spektrofluorimetrija, CD spektroskopija, mikrokalorimetrija, FTIR, SPR, masena spektrometrija.
  2. Tehnike proteomiksa i metabolomiksa.
  3. Primena fluorescentne spektroskopije u biohemiji. Prirodne flurofore u proteinima. Uticaj okoline u proteinima na emisiju triptofana. Primena spektroflurimetrije za određivanje interakcija proteina i liganda. Metoda gašenja fluorescence triptofana. Tercijarna struktura i fluroresencija proteina.
  4. - Definicija cirkularnog dihroizma u biohemiji, pojam sekundarne i tercijarne strukture proteina; određivanje konformacije proteina i nukleinskih kiselina; utvrđivanje konformacionih promena tokom protein-protein, protein-ligand, protein-DNK, DNK-ligand interakcija.
    - Određivanje vezivnih konstanti metodama: direktne titracije, serijskim razblaženjem kompleksa, promene stabilnosti tokom hemisjke i termalne denaturacije.
  5. Analiza CD spektara pomoću: softvera Spektar menadžer, određivanje sekundarne strukture u proteinima upotrebom CD Pro softvera.
  6. - Metode masene spekrometrije u proteomici.
    - Metode koje mogu da se kupluju sa masenom spektrometrijom pri radu u proteomici: tečna hromatografija (HPLC) na nano skali, kapilarna elektroforeza, dvodimenzionalna elektroforeza.
    - Priprema uzorka za masenu spektrometriju. "Bottom up proteomics": identifikacija i karakterizacija proteina metodom "Peptidnog mapiranja", de novo sekvenciranje, analiza post-translacionih modifikacija (hidroksilacija, fosforilacija), mapiranje disulfida, kvantifikacija proteina (metodama SILAC, iTRAQ, label-free kvantifikacija), analiza multiproteinskih kompleksa i ćelijskih organela. Imunoproteomiks. "Top down protomics": određivanje egzaktne mase proteina i peptida, analiza post-translacionih modifikacija (glikozilacija,fosforilacija).
    - Analiza masenih spektara uz pomoć softvera i algoritama: Mascot, Sequest, Profound, X!tandem, MassMatrix, ProSight.
    - Primena masene spektrometrije za kvantifikaciju proteina u kompleksnim uzorcima i biološkim fluidima.
  7. Metode masene spektrometrije u metabolomici. Analiza malih molekula. Metaboličke modifikacije malih molekula. Primena metabolomike u farmakodinamskim ispitivanjima.

Laboratorijske vežbe:

20 poena (4 časa nedeljno)

Program rada:

  1. Snimanje fluorescentnih spektara proteina.
  2. Određivanje konstante vezivanja retinola za beta- laktoglobulin.
  3. Određivanje konstanti vezivanja odabranih polifenola za beta-laktoglobulin metodom gašenja fluorescence triptofana.
  4. Određivanje tačke topljenja proteina spetrofluorimetrijskom metodom: priprema i karakterizacija I, S i N formi ovalbumina spetroflurimetrijom i CD spektroskopijom.
  5. Snimanje proteinskih CD spektara i određivanje sadržaja sekundarnih struktura u proteinima.
  6. Praćenje konformacionih promena proteina prilikom termalne denaturacije CD spektroskopijom.
  7. Praćenje konformacionih promena proteina denaturacije haotropnim agensom CD spektroskopijom.
  8. Određivanje egkzaktne mase proteina masenom spektrometrijom.
  9. Peptidno mapiranje (PMF) proteina i proteomiks
    - redukcija i alkilacija uzorka u rastvoru;
    - priprema uzoraka za PMF nakon 2D elektroforeze;
    - digestija endoproteinazama;
    - hromatografsko razdvajanje peptida na nano reverzno-faznoj hromatografiji i analiza peptida pomoću LTQ Obritrap XL masenog spektrometra;
    - analiza masenih spektara uz pomoć softvera i algoritama: Mascot, Sequest, X!tandem, Profound, MassMatrix, ProSight.
  10. Određivanje post-traslacionih modifikacija proteina.
    - Hidroksilacija i fosforilacija.
    - Određivanje položaja disulfidnih mostova u proteinima.
  11. Kvantitativna proteomika - određivanje koncentracije proteina u smeši.
    - Relativna i apsolutna kvantifikacija.
    - Upotreba programa Skyline.

Kolokvijumi:

20 poena

Pismeni ispit:

50 poena